Asosiy farq – Shimoliy va Janubiy va Western Blotting
DNK, RNK va oqsillarning o'ziga xos ketma-ketligini aniqlash Molekulyar biologiyada turli xil tadqiqotlar uchun zarurdir. Jel elektroforez - bu DNK, RNK va oqsillarni o'lchamlari bo'yicha ajratadigan usul. Jel profillaridan ma'lum DNK ketma-ketligi, RNK ketma-ketligi yoki oqsil etiketli zondlar bilan blotting va gibridizatsiya deb ataladigan maxsus usullar bilan aniqlanadi. Uch xil turdagi tozalash usullari mavjud: janubiy, shimoliy va g'arbiy. Shimoliy janubiy va g'arbiy bloting o'rtasidagi asosiy farq namunadan aniqlangan molekula turiga bog'liq. Southern blotting - bu DNK namunasidan ma'lum bir DNK ketma-ketligini aniqlaydigan usul. Northern blotting - bu RNK namunasidan ma'lum bir RNK ketma-ketligini aniqlaydigan usul. Western blotting - bu oqsil namunasidan ma'lum bir oqsilni aniqlaydigan usul.
Soutern Blotting nima?
Southern blotting texnikasi 1975 yilda E. M. Southern tomonidan DNK namunasidan ma'lum DNK ketma-ketligini aniqlash uchun ishlab chiqilgan. Bu molekulyar biologiyaga kiritilgan birinchi blotting texnikasi. Bu DNK dan o'ziga xos genlarni, DNK dan o'ziga xos bo'laklarni va hokazolarni aniqlash imkonini berdi. Southern blotting texnikasi bir necha bosqichlarni o'z ichiga oladi. Ular quyidagicha.
- DNK namunadan ajratib olinadi va cheklovchi endonukleazlar bilan hazm qilinadi.
- Hazm qilingan namuna agaroz gel elektroforezi bilan ajratiladi.
- Jeldagi DNK fragmentlari ishqoriy eritma yordamida bitta zanjirga denatüratsiya qilinadi.
- Bir zanjirli DNK kapillyar orqali nitrotsellyuloza filtri membranasiga o'tkaziladi.
- Transfer qilingan DNK doimiy ravishda membranaga mahkamlanadi.
- Membranada mahkamlangan DNK yorliqli zondlar bilan gibridlangan.
- Bogʻlanmagan DNK membranadan yuvish orqali yuviladi.
- Rentgen plyonkasi membranaga qo'yiladi va avtoradiograf tayyorlanadi.
Southern blotting molekulyar biologiyaning turli jihatlari uchun qo'llaniladi. Bu RFLP xaritalash, sud-tibbiy tadqiqotlar, gen ekspressiyasida DNK metilatsiyasi, genetik kasalliklarda mutatsiyaga uchragan genlarni aniqlash, DNK barmoq izini va hokazolarda foydalidir.
01-rasm: Janubiy Blotting texnikasi
Northern Blotting nima?
Northern blotting gen ifodasini oʻrganish uchun namunadan maʼlum bir RNK ketma-ketligini yoki mRNK ketma-ketligini aniqlashga moʻljallangan usuldir. Bu usul 1979-yilda Alwine, Kemp va Stark tomonidan ishlab chiqilgan. U sourthern va western blotting texnikasidan bir necha bosqichlar tufayli farq qiladi. Biroq, bu usul, shuningdek, jel elektroforezi, blotting va maxsus etiketli zondlar va aniqlash bilan duragaylash orqali ham amalga oshiriladi. Northern blotting texnikasi quyidagicha amalga oshiriladi.
- RNK namunadan olinadi va gel elektroforezi bilan ajratiladi.
- RNK jeldan qurituvchi membranaga o'tkaziladi va mahkamlanadi.
- Membranaga cDNK yoki RNK dan tayyorlangan yorliqli prob bilan ishlov beriladi (zond namunadagi ma'lum bir ketma-ketlikni to'ldiradi).
- Prob ma'lum bir ketma-ketlik bilan bog'lanish uchun membrana bilan inkubatsiya qilinadi.
- Bogʻlanmagan zondlar yuviladi.
- Gibridlangan parchalar avtoradiograf tomonidan aniqlanadi.
Northern blotting gibridlangan mRNKni aniqlash va miqdorini aniqlashda, RNK degradatsiyasini oʻrganishda, RNKning yarim yemirilish davrini baholashda, RNK qoʻshilishini aniqlashda, gen ifodasini oʻrganishda va hokazolarda muhim vositadir.
02-rasm: Northern Blotting
Western Blotting nima?
Western blotting - etiketli antikor yordamida oqsil aralashmasidan ma'lum bir oqsilni aniqlash usuli. Shuning uchun western blot immunoblot sifatida ham tanilgan. Ushbu usul 1979 yilda Towbin va boshqalar tomonidan kiritilgan va u hozirda protein tahlili uchun laboratoriyalarda muntazam ravishda amalga oshiriladi. Qadamlar quyidagicha.
- Proteinlar namunadan olinadi
- Oqsillar oʻlchamlari boʻyicha poliakrilamid gel elektroforezi yordamida ajratiladi
- Ajratilgan molekulalar elektroporatsiya yoʻli bilan PVDF membranasiga yoki nitroselüloza membranasiga oʻtkaziladi
- Membrana antikorlar bilan nonspesifik bogʻlanish uchun bloklangan
- Transfer qilingan oqsillar birlamchi antikor (fermentli antikorlar) bilan bogʻlanadi.
- Membrana oʻziga xos boʻlmagan bogʻlangan birlamchi antikorlarni olib tashlash uchun yuviladi
- Bogʻlangan antikorlar substrat qoʻshish va hosil boʻlgan rangli choʻkmani aniqlash orqali aniqlanadi
Western blotting inson sarum namunasida OIVga qarshi antikorlarni aniqlashda foydalidir. Western blot gepatit B infektsiyasini tasdiqlovchi test va jinni sigir kasalligi uchun aniq test sifatida ham qo'llanilishi mumkin.
03-rasm: Western Blotting
Shimoliy Janubiy va G'arbiy Blotting o'rtasidagi farq nima?
Northern vs Southern vs Western Blotting |
|
| Molekula turi aniqlandi | |
| Northern Blotting | Northern blotting RNK namunasidan ma'lum RNK ketma-ketligini aniqlaydi. |
| Southern Blotting | Southern blotting DNK namunasidan ma'lum DNK ketma-ketligini aniqlaydi. |
| Western Blotting | Western blotting oqsil namunasidan ma'lum bir oqsilni aniqlaydi. |
| Gel turi | |
| Northern Blotting | Bunda agaroza/formaldegid gel ishlatiladi. |
| Southern Blotting | Bunda agaroza jeli ishlatiladi. |
| Western Blotting | Bunda poliakrilamid gel ishlatiladi. |
| Blotting usuli | |
| Northern Blotting | Bu kapillyar oʻtkazma. |
| Southern Blotting | Bu kapillyar oʻtkazma. |
| Western Blotting | Bu elektr uzatish. |
| Ishlatilgan zondlar | |
| Northern Blotting | cDNK yoki RNK zondlari radioaktiv yoki radioaktiv emas. |
| Southern Blotting | DNK zondlari radioaktiv yoki radioaktiv bo'lmagan deb etiketlanadi. |
| Western Blotting | Birlamchi antikorlar zond sifatida ishlatiladi. |
| Aniqlash tizimi | |
| Northern Blotting | Bu avtoradiograf yoki yorugʻlik yoki rang oʻzgarishini aniqlash yordamida amalga oshiriladi. |
| Southern Blotting | Bu avtoradiograf, yorugʻlik yoki rang oʻzgarishini aniqlash yordamida amalga oshiriladi. |
| Western Blotting | Bu yorugʻlik yoki rang oʻzgarishini aniqlash yordamida amalga oshiriladi. |
Xulosa – Shimoliy va Janubiy va Western Blotting
Blotting - bu namunalardan o'ziga xos DNK, RNK yoki oqsilni aniqlash uchun ishlab chiqilgan maxsus texnika. Muayyan turdagi molekulalarni aniqlash uchun uchta alohida bloting protsedurasi mavjud, xususan, shimoliy, janubiy va g'arbiy. Northern blotting texnikasi RNK aralashmasidan ma'lum bir RNK ketma-ketligini aniqlash uchun mo'ljallangan. Southern blotting texnikasi DNK namunasidan ma'lum DNK ketma-ketligini aniqlash imkonini beradi va western blotting texnikasi oqsil aralashmasidan ma'lum bir oqsilni aniqlash uchun ishlab chiqilgan.
