Asosiy farq – Sanger Sequencing va Pyrosequencing
DNK ketma-ketligi DNK tahlili uchun juda muhim, chunki ma'lum bir DNK hududida nukleotidlarning to'g'ri joylashishini bilish u haqida ko'plab muhim ma'lumotlarni ochib beradi. DNK sekvensiyasining turli usullari mavjud. Sanger sekvensiyasi va Pyrosequencing molekulyar biologiyada keng qo'llaniladigan ikki xil DNK ketma-ketligi usulidir. Sanger sekvensiyasi va Pyrosequencing o'rtasidagi asosiy farq shundaki, Sanger ketma-ketligi nukleotidlar ketma-ketligini o'qish uchun DNK sintezini tugatish uchun dideoksinukleotidlardan foydalanadi, pirosequencing esa nukleotidlarni o'z ichiga olgan holda va to'ldiruvchi ketma-ketlikni o'qish tartibini sintez qilish orqali pirofosfat ajralib chiqishini aniqlaydi.
Sanger ketma-ketligi nima?
Sanger sekvensiyasi 1977-yilda Frederik Sanger va uning kollejlari tomonidan ishlab chiqilgan birinchi avlod DNK sekvensiyasi usulidir. U zanjirni tugatish ketma-ketligi yoki Dideoksi sekvensiyasi sifatida ham tanilgan, chunki u dideoksinukleotidlar (ddNTP) bilan zanjirni tugatishga asoslangan. Ushbu usul 30 yildan ortiq vaqt davomida Yangi avlod ketma-ketligi (NGS) ishlab chiqilgunga qadar keng qo'llanilgan. Sanger sekvensiyasi texnikasi nukleotidlarning to'g'ri tartibini yoki ma'lum bir DNK fragmentini biriktirish imkonini berdi. Bu in vitro DNK replikatsiyasi jarayonida ddNTP larning tanlab qo'shilishi va DNK sintezini to'xtatishga asoslangan. Qo'shni nukleotidlar o'rtasida fosfodiester bog'lanishini davom ettirish uchun 3' OH guruhlari yo'qligi ddNTPlarning o'ziga xos xususiyati hisoblanadi. Demak, ddNTP biriktirilgandan so'ng, zanjir uzayishi to'xtaydi va shu nuqtadan tugaydi. Sanger sekvensiyasida ishlatiladigan to'rtta ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP va ddTTP mavjud. Ushbu nukleotidlar DNKning o'sib borayotgan zanjiriga kiritilganda DNK replikatsiya jarayonini to'xtatadi va natijada qisqa DNKning turli uzunliklari paydo bo'ladi. Kapillyar gel elektroforezi 01-rasmda ko'rsatilganidek, bu qisqa DNK iplarini jelda o'lchamlari bo'yicha tartibga solish uchun ishlatiladi.
1-rasm: sintezlangan qisqa DNKning kapillyar gel elektroforezi
DNKning in vitro replikatsiyasi uchun bir nechta talablar bajarilishi kerak. Bular DNK polimeraza fermenti, shablon DNK, oligonukleotid primerlari va deoksinukleotidlar (dNTP). Sanger sekvensiyasida DNK replikatsiyasi to'rt turdagi ddNTPlar bilan birga to'rtta alohida sinov naychalarida amalga oshiriladi. Deoksinukleotidlar tegishli ddNTPlar bilan to'liq almashtirilmaydi. Muayyan dNTP aralashmasi (masalan, dATP + ddATP) naychaga kiritiladi va takrorlanadi. To'rtta alohida kolba mahsuloti to'rtta alohida quduqda jelda ishlaydi. Keyin jelni o'qib, ketma-ketlikni 02-rasmda ko'rsatilganidek qurish mumkin.
02-rasm: Sanger ketma-ketligi
Sanger ketma-ketligi molekulyar biologiyaning ko'plab sohalarida yordam beradigan muhim texnikadir. Inson genomi loyihasi Sanger sekvensiyasiga asoslangan usullar yordamida muvaffaqiyatli yakunlandi. Sanger sekvensiyasi maqsadli DNK ketma-ketligi, saraton va genetik kasalliklarni tadqiq qilish, gen ekspressiyasini tahlil qilish, odamni identifikatsiyalash, patogenni aniqlash, mikroblar ketma-ketligi va hokazolarda foydalidir.
Sanger ketma-ketligining bir qancha kamchiliklari bor:
- Sekvensiya qilinayotgan DNK uzunligi 1000 ta asosiy juftlikdan uzun boʻlmasligi kerak
- Bir vaqtning oʻzida faqat bitta ipni ketma-ketlashtirish mumkin.
- Jarayon ko'p vaqt talab etadi va qimmat.
Shuning uchun vaqt oʻtishi bilan ushbu muammolarni bartaraf etish uchun yangi ilgʻor ketma-ketlik texnikasi ishlab chiqildi. Biroq, Sanger ketma-ketligi taxminan 850 tagacha boʻlgan tayanch juft uzunlikdagi fragmentlarning yuqori aniqligi tufayli qoʻllanilayapti.
Pyrosequencing nima?
Pyrosequencing - bu “sintez orqali ketma-ketlik”ga asoslangan yangi DNK ketma-ketlik texnikasi. Bu usul nukleotidlarning birikishida pirofosfat chiqishini aniqlashga asoslanadi. Jarayon to'rt xil ferment tomonidan qo'llaniladi: DNK polimera, ATP sulfurilaza, lusiferaza va apiraza va ikkita substrat adenozin 5' fosfosulfat (APS) va lusiferin.
Jarayon bir ipli DNK shablonini primer bilan bog'lashdan boshlanadi va DNK polimeraza uni to'ldiruvchi nukleotidlarni qo'shishni boshlaydi. Nukleotidlar birlashganda (nuklein kislotaning polimerlanishi) pirofosfat (ikkita fosfat guruhi bir-biriga bog'langan) guruhlari va energiyani chiqaradi. Har bir nukleotid qo'shilishi ekvimolyar miqdordagi pirofosfatni chiqaradi. APS substrati ishtirokida pirofosfat ATP sulfurilaza tomonidan ATP ga aylanadi. Yaratilgan ATP lusiferaza vositasida lusiferinning oksilusiferinga aylanishini ta'minlaydi va ATP miqdoriga mutanosib bo'lgan miqdorda ko'rinadigan yorug'lik hosil qiladi. Yorug'lik fotonni aniqlash qurilmasi yoki fotoko'paytirgich orqali aniqlanadi va pirogramma hosil qiladi. Apiraz reaktsiya aralashmasida ATP va qo'shilmagan dNTPlarni parchalaydi. dNTP qo'shilishi bir vaqtning o'zida amalga oshiriladi. Nukleotid qo'shilishi yorug'likning qo'shilishi va aniqlanishiga ko'ra ma'lum bo'lganligi sababli, shablonning ketma-ketligini aniqlash mumkin. Pirogramma 03-rasmda ko'rsatilganidek DNK namunasining nukleotidlar ketma-ketligini yaratish uchun ishlatiladi.
Pyrosequencing yagona nukleotid polimorfizmini tahlil qilish va DNKning qisqa qismlarini ketma-ketlashtirishda juda muhimdir. Yuqori aniqlik, moslashuvchanlik, avtomatlashtirish qulayligi va parallel ishlov berish Sanger sekvensiyasi texnikasidan ustunlik qiladi.
03-rasm: Pyrosequencing
Sanger Sequencing va Pyrosequencing o'rtasidagi farq nima?
Sanger ketma-ketligi va pirosekvensiya |
|
| Sanger sekvensiyasi bu DNK polimeraza va zanjirning uzilishi orqali ddNTPlarni tanlab birlashtirishga asoslangan DNK sekvensiyasi usulidir. | Pyrosequencing - bu nukleotid qo'shilishi natijasida pirofosfat ajralib chiqishini aniqlashga asoslangan DNK sekvensiyasi usuli. |
| ddNTPdan foydalanish | |
| ddNTPlar DNK replikatsiyasini tugatish uchun ishlatiladi | ddNTP ishlatilmaydi. |
| Ishtirok etgan fermentlar | |
| DNK polimeraza ishlatiladi. | To'rtta ferment ishlatiladi: DNK polimeraza, ATP sulfurilaza, Lusiferaza va Apiraz. |
| Ishlatilgan substratlar | |
| APS va Luciferin ishlatilmaydi. | Adenozin 5' fosfosulfat (APS) va lusiferin ishlatiladi. |
| Maksimal harorat | |
| Bu sekin jarayon. | Bu tez jarayon. |
Xulosa – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger sekvensiyasi va Pyrosequencing molekulyar biologiyada qo'llaniladigan DNK ketma-ketligining ikkita usulidir. Sanger sekvensiyasi zanjirning uzayishini tugatish orqali nukleotidlarning ketma-ket tartibini tuzadi, pirosequencing esa nukleotidlarning birlashishi va pirofosfatlarning chiqarilishini aniqlash orqali nukleotidlarning aniq tartibini ketma-ketlikda tuzadi. Shuning uchun, Sanger sekvensiyasi va Pyrosequencing o'rtasidagi asosiy farq shundaki, Sanger sekvensiyasi zanjirni tugatish orqali ketma-ketlikda ishlaydi, pirosequencing esa sintez orqali ketma-ketlikda ishlaydi.
