Asosiy farq – Gen klonlash va PCR
Ma'lum bir DNK bo'lagidan DNKning ko'p nusxalarini sintez qilish DNK amplifikatsiyasi deb ataladi. DNKni kuchaytirishning ikkita asosiy jarayoni mavjud: genlarni klonlash va PCR. Genlarni klonlash va PCR o'rtasidagi asosiy farq shundaki, genlarni klonlash rekombinant DNKni yaratish va xost bakteriyasida o'sish orqali ma'lum bir genning ko'p nusxalarini in vivo hosil qiladi, PCR esa takroriy tsikllardan o'tib, ma'lum bir DNK fragmentining millionlab nusxalarini in vitro ishlab chiqaradi. denaturatsiya va sintez.
Gen klonlash nima?
Genlarni klonlash - bu rekombinant DNKni qurish orqali organizmning olingan genomik DNKsidan ma'lum bir genni topish va ko'paytirish uchun qo'llaniladigan usul. Genomik DNKda oqsillar uchun kodlangan minglab turli genlar mavjud. DNK chiqarilganda, u ko'tara oladigan barcha genlarni o'z ichiga oladi. Genni klonlash texnikasi umumiy DNKdan ma'lum bir genni aniqlash imkonini berdi. Shuning uchun genlarni klonlash molekulyar biologiyada muhim vosita bo'lib xizmat qiladi.
Organizmning genomik kutubxonasini yaratish, agar DNKda tegishli genning joylashuvi haqida hech qanday ma'lumot bo'lmasa, genlarni klonlashda muhim ahamiyatga ega. Genomik kutubxona quyidagi bosqichlar yordamida yaratiladi.
1-qadam: Istalgan genni o'z ichiga olgan organizmdan umumiy DNKni ajratib olish.
2-qadam: Kichik boshqariladigan bo'laklarni hosil qilish uchun olingan DNKning hazm bo'lishini cheklash. Bu bosqichni cheklovchi endonukleazlar osonlashtiradi.
3-qadam: mos vektorni tanlash va vektor DNKni bir xil cheklash endonukleazlari yordamida ochish. Bakterial plazmidlar odatda begona DNKni tashish uchun vektor sifatida ishlatiladi. Plazmidlar bakteriyalar ichida joylashgan DNKning kichik doiralaridir.
4-qadam: Rekombinant DNK molekulasini hosil qilish uchun vektor DNK va parchalangan DNKni birlashtirish. Bu bosqich DNK ligazasi tomonidan boshqariladi.
5-qadam: Rekombinant DNK molekulalarini xost bakteriyalariga o'tkazish. Bu bosqich transformatsiya deb nomlanadi va issiqlik zarbasi yordamida amalga oshiriladi.
5-qadam: Madaniyat muhitida o'zgartirilgan bakterial hujayralarni skrining qilish. Transformatsiya jarayoni oxirida o'zgartirilgan va o'zgartirilmagan xost hujayralarining aralash populyatsiyasi olinadi. Qiziqish geniga faqat o'zgartirilgan xost hujayralari kiradi. Demak, o'zgartirilgan hujayralarni tanlash kerak. Tanlash antibiotiklarni o'z ichiga olgan selektiv vositalar yordamida amalga oshiriladi. Bu skrining muhitida faqat o‘zgartirilgan hujayralar o‘sadi, bu esa tanlash imkonini beradi.
6-qadam: Gen kutubxonasini yaratish uchun bakteriyalarni o'stirish. Ushbu bosqichda o'zgartirilgan xost hujayralari optimal o'sish talablarini ta'minlaydigan yangi madaniyat muhitiga kiritiladi. Madaniyat plitalaridagi umumiy koloniyalar bu organizmning genomik kutubxonasini ifodalaydi.
7-qadam: Qiziqarli genni o'z ichiga olgan rekombinant DNK molekulasi rekombinant DNKning minglab klonlangan bo'laklaridan tekshirilishi kerak. Bunga o'ziga xos genni yoki o'sha gendan olingan o'ziga xos protein natijalarini belgilaydigan zondlardan foydalanish orqali erishish mumkin.
Bakteriya koloniyasini oʻz ichiga olgan manfaatdor gen umumiy koloniyalardan aniqlangandan soʻng, genni oʻz ichiga olgan rekombinant plazmidning millionlab nusxalarini yaratish mumkin.
Genlarni klonlash gen kutubxonalarini yaratishda, maxsus oqsillar, vitaminlar, antibiotiklar, gormonlar ishlab chiqarishda, organizmlar genomlarini ketma-ketlashtirish va xaritalashda, sud-tibbiyot ekspertizasida shaxslar DNKsining bir nechta nusxalarini yaratishda va hokazolarda ishlatiladi.
1-rasm: Genlarni klonlash
PCR nima?
Polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) bu ma'lum bir DNK fragmentining ko'p sonli nusxalarini yaratadigan texnikadir. Muayyan DNK ketma-ketligini eksponensial kuchaytirish in vitro sharoitida PCR orqali olinadi. Ushbu usul molekulyar biologiyada juda kuchli vositadir, chunki u kichik DNK namunasini foydalanish mumkin bo'lgan miqdorga ko'paytirishi mumkin. PCR 1983-yilda Kari Mullis tomonidan taqdim etilgan va bu sovrinli ixtiro molekulyar biologiyada katta yutuq yaratdi.
PCR texnikasi 02-rasmda ko'rsatilganidek, takroriy PCR reaktsiyalaridan keyin amalga oshiriladi. Bitta PCR reaktsiyasi uch xil haroratda sodir bo'ladigan uchta asosiy bosqichdan iborat; 94 0C da DNKda qo'sh ipning denaturatsiyasi, 68 0C da primerlarning tavlanishi va 72 0 da cho'zilishi C. Shuning uchun, PCR amalga oshirilganda, to'g'ri replikatsiya qilish uchun harorat o'zgarishi yuqori darajada saqlanishi kerak. PCR, PCR naychalari ichidagi PCR mashinasida amalga oshiriladi. PCR naychalari shablon DNK, Taq polimeraza, primerlar, dNTP va buferni o'z ichiga olgan to'g'ri PCR aralashmalari bilan to'ldiriladi. Ikki zanjirli namunali DNKning bir zanjirli DNKga denaturatsiyasi 94 – 98 0C da komplementar asoslar orasidagi vodorod aloqalarini uzish orqali amalga oshiriladi. Keyin DNK shablonining bitta iplari primerlar uchun ochiladi. Bir juft primer (oldinga va teskari) ta'minlanishi kerak va ular yuqori haroratga toqat qilish uchun termostabil bo'lishi kerak. Primerlar maqsadli DNK fragmentining uchlarini to'ldiruvchi bir zanjirli qisqa DNK ketma-ketligidir. PCRda sintetik primerlar qo'llaniladi. Primerlar DNK namunasining qo'shimcha asoslari bilan bog'lanadi va yangi zanjirning sintezini boshlaydi. Bu bosqich Taq polimeraza deb ataladigan ferment tomonidan katalizlanadi; Thermus auqaticus'dan ajratilgan termostabil DNK polimeraza fermenti. Primerlar va nukleotidlar (qurilish bloklari) mavjud bo'lganda, Taq polimeraza DNK shablonini to'ldiruvchi yangi DNK zanjirini yaratadi. PCR dasturining oxirida gel elektroforezi yordamida kuchaytirilgan DNK fragmenti kuzatiladi. Agar qo'shimcha tahlil zarur bo'lsa, PCR mahsuloti jeldan tozalanadi.
PCR genetik va orttirilgan kasalliklar diagnostikasi va monitoringi, jinoyatchilarni aniqlash (sud-tibbiyot sohasida), DNKning maqsadli segmentining tuzilishi va funksiyasini o'rganish, organizmlar genomlarini ketma-ketlashtirish va xaritalash, PCR olimlar orasida tibbiy va molekulyar biologiya tadqiqot laboratoriyalarida odatiy laboratoriya usuliga aylandi, chunki u keng ko'lamli ilovalarga ega.
2-rasm: Polimeraza zanjiri reaktsiyasi
Gen klonlash va PCR o'rtasidagi farq nima?
Gen klonlash va PCR |
|
| Genlarni klonlash - bu rekombinant DNK orqali ma'lum bir genning in vivo bir necha nusxasini yaratish va xost bakteriyaga aylantirish jarayoni. | PZR texnikasi PCR reaktsiyalarining takroriy sikllari orqali in vitroda ma'lum bir DNK ketma-ketligining bir nechta nusxalarini ishlab chiqaradi. |
| Rekombinant DNKni qurish talabi | |
| Rekombinant DNK genni aniqlash uchun ishlab chiqariladi. | Rekombinant DNK ishlab chiqarilmaydi. |
| Mehnatga ehtiyoj | |
| Bu jarayon koʻp mehnat talab qiladi. | Intensiv mehnat kerak emas. |
| In vivo yoki In vitro jarayon | |
| Rekombinant DNKning tuzilishi in vitro va DNKning kuchayishi in vivo. | DNKning kuchayishi butunlay in vitroda sodir boʻladi. |
Xulosa – Gen klonlash va PCR
Genlarni klonlash va PCR DNKni kuchaytirish uchun ishlatiladigan ikkita usuldir. PCR - bu rekombinant DNK va xost organizmidan foydalanmasdan ma'lum bir DNK fragmentining DNKsining bir nechta nusxalarini yaratadigan in vitro jarayon. Genlarni klonlash birinchi navbatda in vivo jarayon bo'lib, rekombinant DNKni qurish orqali xost organizmida manfaatdor genning bir nechta nusxalarini keltirib chiqaradi. Bu gen klonlash va PCR o'rtasidagi farq.
