Asosiy farq – NGS va Sanger Sequencing
Keyingi avlod ketma-ketligi (NGS) va Sanger ketma-ketligi vaqt davomida ishlab chiqilgan ikki turdagi nukleotidlar ketma-ketligi texnikasi. Sanger Sequencing usuli ko'p yillar davomida keng qo'llanilgan va NGS o'zining afzalliklari tufayli uni yaqinda almashtirdi. NGS va Sanger Sequencing o'rtasidagi asosiy farq shundaki, NGS bir vaqtning o'zida millionlab ketma-ketliklarni ketma-ketlik tizimi orqali tez yo'l bilan ketma-ketlashtirish printsipi asosida ishlaydi, Sanger Sequencing esa DNK polimeraza fermenti tomonidan dideoksinukleotidlarni tanlab qo'shilishi tufayli zanjirni tugatish printsipi ustida ishlaydi. kapillyar elektroforez bilan DNK replikatsiyasi va natijada fragmentlarni ajratish paytida.
Nukleotidlar ketma-ketligi nima?
Genetik ma'lumot organizmning DNK yoki RNK nukleotidlari ketma-ketligida saqlanadi. Berilgan fragmentdagi (gen, genlar klasteri, xromosoma va to'liq genomda) nukleotidlarning to'g'ri tartibini (to'rtta asosdan foydalangan holda) aniqlash jarayoni nukleotidlar ketma-ketligi deb nomlanadi. Genlarning tuzilishi va funktsiyasini tahlil qilish genomik tadqiqotlar, sud ekspertizasi, virusologiya, biologik sistematik, tibbiy diagnostika, biotexnologiya va boshqa ko'plab sohalarda juda muhimdir. Olimlar tomonidan ishlab chiqilgan ketma-ketlik usullarining har xil turlari mavjud. Ular orasida 1977-yilda Frederik Sanger tomonidan ishlab chiqilgan Sanger sekvensiyasi keng qoʻllanilgan va uzoq vaqt davomida Next Generation Sequencing uning oʻrnini bosguniga qadar ommalashgan.
NGS nima?
Keyingi avlod ketma-ketligi (NGS) - bu zamonaviy yuqori o'tkazuvchanlik ketma-ketlik jarayonlariga ishora qilish uchun ishlatiladigan atama. U genomik tadqiqotlar va molekulyar biologiyani inqilob qilgan bir qator turli xil zamonaviy ketma-ketlik texnologiyalarini tavsiflaydi. Bu usullar Illumina sequencing, Roche 454 sequencing, Ion Proton sequencing va SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection) sekvensiyasidir. NGS tizimlari tezroq va arzonroq. NGS tizimlarida to'rtta asosiy DNK tartiblash usullari qo'llaniladi, xususan; pyrosequencing, sintez yo'li bilan ketma-ketlik, ligatsiya va ion yarimo'tkazgichlar ketma-ketligi. Ko'p sonli DNK yoki RNK zanjirlari (millionlab) parallel ravishda ketma-ket joylashtirilishi mumkin. Bu ko'proq vaqt talab qiladigan Sanger sekvensiyasidan farqli o'laroq, qisqa vaqt ichida organizmlarning butun genomini ketma-ketlashtirish imkonini beradi.
NGS an'anaviy ketma-ketlik Sanger usulidan ko'p afzalliklarga ega. Bu kichik namuna o'lchami bilan bajarilishi mumkin bo'lgan yuqori tezlik, aniqroq va tejamkor jarayon. NGS metagenomik tadqiqotlarda, kiritish va oʻchirish va hokazolar tufayli individual genom ichidagi oʻzgarishlarni aniqlashda hamda gen ifodalarini tahlil qilishda qoʻllanilishi mumkin.
1-rasm: NGS Sequencing ishlanmalari
Sanger ketma-ketligi nima?
Sanger Sequencing - 1977 yilda Frederik Sanger va uning hamkasblari tomonidan berilgan DNK fragmentining nukleotidlar tartibini aniq aniqlash uchun ishlab chiqilgan ketma-ketlik usuli. U shuningdek, zanjirni tugatish ketma-ketligi yoki Dideoksi sekvensiyasi sifatida ham tanilgan. Ushbu usulning ishlash printsipi DNKning replikatsiyasi jarayonida DNK polimeraza tomonidan ddGTP, ddCTP, ddATP va ddTTP kabi zanjir tugatuvchi dideoksinukleotidlarni (ddNTP) tanlab qo'shilishi bilan zanjir sintezini tugatishdir. Oddiy nukleotidlar zanjir hosil bo'lishini davom ettirish uchun qo'shni nukleotidlar o'rtasida fosfodiester bog'lanish hosil qilish uchun 3' OH guruhlariga ega. Biroq, ddNTPlarda bu 3' OH guruhi yo'q va nukleotidlar o'rtasida fosfodiester aloqalarini hosil qila olmaydi. Shunday qilib, zanjir cho'zilishi to'xtatiladi.
Ushbu usulda ketma-ketlashtiriladigan bir zanjirli DNK in vitro DNK sintezi uchun shablon zanjiri boʻlib xizmat qiladi. Boshqa talablar - oligonükleotid primeri, deoksinukleotid prekursorlari va DNK polimeraza fermenti. Maqsadli fragmentning yon tomonlari ma'lum bo'lganda, primerlarni DNK replikatsiyasi uchun osongina loyihalash mumkin. To'rtta alohida DNK sintezi reaktsiyalari to'rtta alohida naychada amalga oshiriladi. Har bir naychada boshqa talablar bilan birga alohida ddNTP mavjud. Muayyan nukleotiddan dNTP va ddNTP aralashmasi qo'shiladi. Xuddi shunday, to'rtta aralashma bilan to'rtta naychada to'rtta alohida reaktsiyalar amalga oshiriladi. Reaksiyalardan so'ng DNK bo'laklarini aniqlash va fragment naqshini ketma-ketlik ma'lumotlariga aylantirish amalga oshiriladi. Olingan DNK fragmentlari issiqlik bilan denatüre qilinadi va gel elektroforez bilan ajratiladi. Agar radioaktiv nukleotidlar ishlatilsa, poliakrilamid jelidagi tarmoqli naqshini avtoradiografiya orqali ko'rish mumkin. Ushbu usul floresan yorliqli dideoksinukleotidlardan foydalanganda, uni jel darajasida kamaytirish va floresan detektor tomonidan aniqlash uchun lazer nuridan o'tkazish mumkin. Ketma-ketlikni ko'z bilan o'qish va kompyuterga qo'lda kiritishda yuzaga kelishi mumkin bo'lgan xatolarni oldini olish uchun ushbu usul kompyuter bilan birlashtirilgan avtomatlashtirilgan sekvenserdan foydalanishga ishlab chiqilgan.
Bu inson genomi loyihasidagi DNKni ketma-ketlashtirish uchun ishlatiladigan usul. Bu usul hali ham ilg‘or o‘zgartirishlar bilan qo‘llanilayapti, chunki u qimmat va sekin jarayon bo‘lishiga qaramay, ketma-ketlik haqida aniq ma’lumot beradi.
2-rasm: Sanger ketma-ketligi
NGS va Sanger Sequencing oʻrtasidagi farq nima?
NGS va Sanger ketma-ketligi |
|
| Keyingi avlod ketma-ketligi (NGS) zamonaviy yuqori oʻtkazuvchanlik sekvensiyasi jarayonlariga ishora qiladi. Unda turli xil zamonaviy ketma-ketlik texnologiyalari tavsiflangan | Sanger Sequencing - bu DNK fragmentining aniq nukleotid tartibini aniqlash uchun Frederik Sanger tomonidan ishlab chiqilgan ketma-ketlik usuli. |
| Xarajat samaradorligi | |
| NGS arzonroq jarayon, chunki u vaqtni, inson kuchini va kimyoviy moddalarni kamaytiradi. | Bu qimmat jarayon, chunki vaqt, inson kuchi va koʻproq kimyoviy moddalar talab etiladi. |
| Tezlik | |
| Bu tezroq, chunki kimyoviy aniqlash va koʻp iplarni signal aniqlash parallel sodir boʻladi. | Bu koʻp vaqt talab etadi, chunki kimyoviy aniqlash va signalni aniqlash ikkita alohida jarayon sifatida sodir boʻladi va bir vaqtning oʻzida faqat ipda oʻqilishi mumkin. |
| Ishonchlilik | |
| NGS ishonchli. | Sanger ketma-ketligi unchalik ishonchli emas |
| Namuna hajmi | |
| NGS kamroq DNK miqdorini talab qiladi. | Bu usul katta miqdorda DNK shablonini talab qiladi. |
| Har bir ketma-ket fragment uchun DNK asoslari | |
| Tarkibli fragmentdagi DNK asoslari soni Sanger usulidan kamroq | Yaratish ketma-ketligi NGS ketma-ketliklaridan uzunroq. |
Xulosa – NGS va Sanger Sequencing
NGS va Sanger Sequencing - bu molekulyar biologiyada keng qo'llaniladigan nukleotidlar ketma-ketligi usullari. Sanger sekvensiyasi - bu NGS bilan almashtirilgan erta ketma-ketlik usuli. NGS va Sanger Sequencing o'rtasidagi asosiy farq shundaki, NGS Sanger sekvensiyasiga qaraganda yuqori tezlik, aniqroq va tejamkor jarayondir. Ikkala usul ham genetika va biotexnologiyada katta epidemiyalarni keltirib chiqardi.
